ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ»
СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
Диссертация
на соискание ученой степени
Автор:
ВАСИЛЬЕВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭКСТРАКТОВ
ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИХ РАСТЕНИЙ
В УСЛОВИЯХ МОДЕЛЕЙ
СИНДРОМА ПОВЫШЕННОЙ ВЯЗКОСТИ КРОВИ
Содержание
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Объекты исследования
Эксперименты проведены на 394 крысах-самцах Вистар, 59 крысах-самцах линии SHR (spontaneously hypertensive rats) и 40 крысах-самцах линии Brattleboro (крысы с наследственным гипоталамическим несахарным диабетом – НГНД). Крысы линий SHR и Brattleboro получены из ФГБУ «НИИ цитологии и генетики» СО РАН (г. Новосибирск), крысы Вистар из ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск). Все использованные в эксперименте животные имели сертификат здоровья и по микробиологическому статусу относились к конвенциональным. Экспериментальные животные были массой 200-260 г, содержались по 8 особей в поликарбонатных клетках (Тип 825 см ) на стандартном рационе вивария при свободном доступе к воде и пище, за исключением отдельных ситуаций, специально оговоренных в данном разделе. Все эксперименты, связанные с регистрацией поведенческих показателей, манипуляции с моделированием патологических процессов высшей нервной деятельности начинались в 10 часов и заканчивались в 15 часов. Эвтаназию производили в соответствии с “Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных”, передозировкой эфирного наркоза.
В экспериментах использовали сухие экстракты левзеи сафлоровидной, лихниса хальцедонского и серпухи венценосной, приготовленные методом реперко- ляции по оригинальной технологии с использованием в качестве экстрагента 25%, 40% и 70% этанола. В качестве сырья для приготовления экстракта левзеи сафлоровидной использовали корневища с корнями, для изготовления экстрактов лихниса хальцедонского и серпухи венценосной – траву. Сухие экстракты левзеи сафлоровидной и фракции предоставлены заведующим кафедрой фармацевтической химии СибГМУ профессором, д.ф.н., Е.А. Красновым. Сухие экстракты лихниса хальцедонского и фракции – заведующей лабораторией фитохимии Сибирского, ботанического сада, д.б.н. Л.Н. Зибаревой. Сухие экстракты серпухи венценосной и фракции – профессором кафедры фармакогнозии СибГМУ, д.ф.н., Г.И. Калинкиной. Экстракты экдистероидсодержащих растений стандартизировали по содержанию экдистероидов хроматоспектрофотометрическим методом [Якубова М.Р. и др., 1978]: концентрации суммы экдистероидов в ЭЛС, ЭЛХ и ЭСВ составили 2,7%, 2,3% и 3,1% соответственно в пересчете на сухую массу.
В качестве препарата сравнения использовали стандартизированный экстракт гинкго билоба (EGb 761) – танакан (Beaufur Ipsin International).
3.2. Методики исследования
Для оценки гемореологического статуса использовали определение следующих параметров: вязкость крови, вязкость плазмы, гематокрит, спонтанную агрегацию эритроцитов, деформируемость эритроцитов и концентрацию фибриногена. Для оценки уровня доставки кислорода к тканям использовали расчетный показатель – отношение гематокрита к вязкости крови (Ht/r|) [Stoltz J.E., Donner M., 1991];
Относительную вязкость крови и плазмы определяли с использованием капиллярного вискозиметра ВК-4 [Селезнев С.А., 1985]. Отрицательное давление 100 мм вод. ст. поддерживали с помощью водоструйного насоса, баростата (колба объемом 7 литров) и ликвороманометра ЛМ-1. В качестве стандартной жидкости использовали дистиллированную воду. Относительную вязкость крови рассчитывали по формуле:
r|=Lg/Lv,
где Lg – расстояние, пройденное в капилляре исследуемой жидкостью от метки “0”; Lv – расстояние, пройденное дистиллированной водой в капилляре от метки “0”.
Для оценки абсолютных значений вязкости крови при различных скоростях сдвига применяли ротационный гемовискозиметр АКР-2 [Левтов В.А., 1982].
Гематокрит оценивали методом центрифугирования в стеклянных капиллярах при помощи центрифуги РС-6 и выражали в %.
Количество фибриногена в плазме определяли на коагулометре KG-IV (Сог- шау) хронометрическим методом по Gauss с использованием диагностического набора Тех-фибриноген-тест (ООО «Технология-стандарт»).
Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали методом силлектометрии [Габриэлян Э.С., Акопов С.Э., 1985]. Метод основан на регистрации яркости света, отраженного от тонкого слоя суспензии эритроцитов в процессе её перемешивания в кювете, причем повышение яркости в ходе перемешивания отражает распад агрегатов, а после остановки мешалки – процесс их образования [Габриэлян Э.С., Акопов С.Э., 1985]. Для установления интенсивности фотометрического сигнала использовали микрофотоколориметр МКМФ-1 с графической регистрацией на графопостроителе Н306. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полу период агрегации (Т1/2 — время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в 2 раза) (рис. 1) [Плотников М.Б. и др., 1995].
| Рис.1. Принципиальный вид кривой дезагрегации-агрегации эритроцитов |
Деформируемость эритроцитов изучали методом лазерной дифрактометрии или эктацитометрии [Фирсов Н.И. и др., 1983; Белкин A.B. и др., 1991; Evans Е., Mohandas N., 1986]. Метод основан на явлении дифракции, наблюдаемом при прохождении лазерного луча через тонкий слой суспензии эритроцитов, взвешенных в вязкой жидкости [Bessis М., Mohandas N., 1975]. В результате на непрозрачном экране отображается дифрактограмма, представляющая собой ряд чередующихся, концентрически расположенных светлых дифракционных максимумов и темных минимумов. Изменение этой картины при приложении напряжения сдвига отражает изменения в форме взвешенных рассеивателей, в нашем случае – эритроцитов [Bessis М. et al., 1980]. Конструкция прибора (рис. 2), основана на эктацитометре, предложенном М. Bessis и N. Mohandas [Bessis М., Mohandas N., 1975], и состоит из двух соосных цилиндрических тонкостенных (толщина стенки составляет 1 мм) стакана (4, 5) из оргстекла. Величина зазора между ними 0,5 мм. Наружный стакан (5) с внутренним диаметром 5,1 см закреплен в оправе (7), которая свободно вращается в системе подшипников и жестко соединена с валом двигателя (8), частота вращения которого меняется в диапазоне от 0 до 170 об/мин (рис. 1). Скорость сдвига в эктацитометре определяли по формуле [Groner W. et al., 1980]: у = 2R TiN/бОе,
где R – внешний радиус внутреннего стакана, мм; е – величина зазора между стаканами, мм; N – частота оборотов наружного стакана в мин.
Для исследования деформируемости эритроцитов применялся диапазон скоростей сдвига от 90 до 890 с”1. Оптическая часть прибора состоит из гелий- неонового лазера ЛНГ-208А (1), луч которого диаметром около 1 мм проходит через линзу (3), установленную на фокусном расстоянии от зеркала (6), находящегося на дне внутреннего цилиндра и, отражаясь от него, проходит горизонтально через стенки цилиндров и слой исследуемой суспензии эритроцитов между ними, создавая на экране (2) дифракционную картину, соответствующую размерам и форме усредненного эритроцита (рис. 2).
Разведение крови подбиралось, исходя из собственных наблюдений и данных литературы [Фирсов Н.И. и др., 1983; Белкин A.B. и др., 1991; Evans Е., Mohandas N., 1986]. Оптимальным являлось разведение в 300 раз. В качестве вязкой среды использовался раствор высокомолекулярного полиэтиленоксида с молекулярной массой 5,8×106 D в концентрации 0,2% и вязкостью 8-13 мРа-с. В качестве растворителя использовали 2% раствор альбумина. Раствор практически не имеет светорассеяния [Фирсов Н.И. и др., 1983]. Для получения достоверной информации о форме эритроцитов достаточно измерения размеров нулевого максимума [Bessis M., Mohandas N., 1975]. Способность эритроцитов к деформируемости выражали в виде индекса (ИДЭ), определяемого по формуле: ИДЭ = А – В/А + В, где А – больший диаметр эллипса; В – меньший диаметр эллипса.
Электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФП) является величиной, определяемой скоростью движения эритроцитов под действием электрического поля единичной напряженности [Харамоненко С.С., Ракитянская A.A., 1974]. ЭФП дает возможность судить о поверхностном заряде эритроцитов, изменения которого прямо связаны с морфофункциональным состоянием мембран красных клеток [Казаков Ю.М., 1981; Прогонная В.В., Романенко А.И., 1982; Петренко Ю.М., Владимирова Ю.Н., 1987; Bater A.I. et al., 1984].
| Рис. 2. Схема эктацитометра.
1 – гелий-неоновый лазер; 2 – экран; 3 – линза; 4 – внутренний стакан; 5 – наружный стакан; 6 – зеркало; 7 – система подшипников; 8 – двигатель; 9 – суспензия эритроцитов. |
Для оценки ЭФП эритроцитов использовали метод клеточного электрофореза [Харамоненко С.С., Ракитянская A.A., 1974; Мищук И.И., 1993]. Схема прибора представлена на рис. 2. Наиболее важная часть прибора – два капилляра (1) с вмонтированными полупроницаемыми мембранами, глубиной 0,6 мм и шириной 12 мм. Расстояние между электродами (2) – 12 мм. Источник (3) постоянного тока (70 V) с возможностью смены полярности тока присоединен к электродам (2). Электроды изготовлены из платины (d=2 мм), так как при использовании постоянного тока необходимо использовать неполяризующиеся электроды. Мембрана капилляров не допускает проникновение электронов в измерительную ячейку, которой служит камера Горяева (4). Эта конструкция обеспечивает необходимую точность измерений [Харамоненко С.С., Ракитянская A.A., 1974]. Схема прибора представлена на рис. 2.
| Рис. 3. Схема прибора для измерения ЭФП эритроцитов.
1 – капилляр с полупроницаемой мембраной; 2 – платиновый электрод; 3 – источник тока; 4 – камера Горяева |
Стабилизированную цитратом кровь центрифугировали при 2000 об/мин, отделяли от плазмы, трижды промывали 0,9% раствором натрия хлорида, затем один раз фосфатным буфером (рН=7,4; осмотическая активность 280 ммоль/кг), который служил средой измерений. Полученную клеточную взвесь разводили фосфатным буфером до 0,05% суспензии. Для определения подвижности эритроцитов фиксировали расстояние, пройденное 10-20 клетками за определенное время (10 сек).
Удельное сопротивление среды определяли экспериментальным путем с помощью специально сконструированной электродной пары и прибора (Измеритель цифровой Ь.С.Я. Е7-8). В наших условиях удельное сопротивление (р) фосфатного буфера составило 0,31 кОм, расстояние между электродами (1) равно 10 мм, рабочая площадь электродов (S) – 30,22 мм . Удельная электропроводность среды (а) равна 0,001067 Ом”1. Далее, используя площадь поперечного сечения электрода с полупроницаемой мембраной (q=0,0314 см ) и показатель силы тока (1=0,1 А) находили градиент потенциала (Н), который был равен 0,0034 V/см и затем ЭФП (U, MKM-V’-ceK^-CM).
Изучение морфологических особенностей эритроцитов осуществляли методом растровой электронной микроскопии [Козинец Г.И., Симоварт Ю.А., 1984]. Для этого биоптаты периферической крови сначала подвергали фиксации 2,5% раствором глутарового альдегида, с дальнейшей постфиксацией материала в 1% растворе четырехокиси осмия. После двухкратного отмывания клеток фосфатным буфером (рН=7,4), дегидратировали их в этиловом спирте возрастающей концентрации (30%, 50%, 70%, 90% и 100%) по 15 минут в каждом. Приготовленную таким образом взвесь клеток наносили тонким слоем на предварительно обработанные химически чистым ацетоном алюминиевые подложки. Образцы высушивали на воздухе при комнатной температуре и напыляли ультратонким слоем серебра толщиной 20 нм. Образцы исследовали в сканирующем электронном микроскопе “РЭМ-200” при ускоряющем напряжении 35 кВ, силе тока 0,63 А, под углом наклона 35°. По форме эритроциты относили к различным типам в соответствии с классификациями, предложенными Г.И. Козинцом [Козинец Г.И., Симоварт Ю.А., 1984] и Б.В. Ионовым [Ионов Б.В., Чернух A.M., 1981]. Производили подсчет 1000 произвольно выбранных эритроцитов в каждой пробе, количественное соотношение различных типов клеток выражали в процентах.
Тени эритроцитов, для изучения липидного состава мембран, получали по методу J.T. Dodge et al. [Dodge J.T. et al., 1963], в основу которого положен принцип гипоосмотического гемолиза. Кровь для исследования брали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в конечной концентрации 50 ЕД/мл крови. Удаляли плазму, эритроциты трижды промывали 0,145 М раствором натрия хлорида в 10 мМ трис-HCl буфере рН=7,4. Надосадочную жидкость удаляли после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут. Гемолиз проводили 1 мМ раствором ЭДТА в 10 мМ трис-HCl буфере на холоде в течение 30 минут постоянно помешивая. Мембраны отмывали 10 мМ трис-HCl буфере рН=7,4 центрифугируя при 15000 об/мин (6000 g) в течение 20 минут.
Липидный экстракт получали методом J. Folch [Folch J. et al., 1957]. Метод заключается в разрушении липидно-белковых связей полярным растворителем (метанолом), что способствует последующему экстрагированию липидов неполярным растворителем (хлороформом). Мембранный осадок ресуспендировали в пробирках, содержащих не менее 20 объемов смеси хлороформ/метанол (2:1). Накрывали пробирки и прогревали на водяной бане (37°С) в течение 15 мин. Экстракт фильтровали и доводили до первоначального объема смесью хлороформ/метанол. Для очистки от нелипидных примесей к экстракту добавляли одну пятую объема 0,05 М KCl и перемешивали. Образующуюся однородную эмульсию центрифугировали, верхнюю фазу удаляли с помощью пастеровской пипетки. Нижнюю фазу промывали, осторожно добавляя “верхнюю фазу”, состоящую из хлороформа/метанола/0,05 М р-ра KCl (8:4:3), оставляли на 10-15 мин, затем удаляли верхний слой. Полученный липидный экстракт доводили до исходного объема (5 мл). Экстракт делили на части, выпаривали на водяной бане при 60°С и использовали для определения общего содержания липидов и их фракций.
Уровень общих липидов в мембранах эритроцитов оценивали по цветной реакции с фосфорно-ванилиновым реактивом [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982]. Метод основан на способности ненасыщенных липидов, жирных кислот, фосфо- липидов и холестерина образовывать при нагревании с серной кислотой карбо- ниевый анион; фосфорная кислота этерифицирует ОН-группу ванилина; карбо- ниевый ион взаимодействует с активированной карбонильной группой ванилина, образуя стабилизированный окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию липидов. К сухому липидному остатку добавляли концентрированную серную кислоту и кипятили на водяной бане 20 минут, охлаждали и добавляли фосфорно-ванилиновый реактив. Пробы помещали в темное место на 1 час. Колориметрировали при длине волны 530 нм в кювете с длиной оптического пути 3 мм.
Общее содержание фосфолипидов определяли по реакции с ферротиоциана- том аммония [Пентюк A.A. и др., 1987]. К пробиркам, содержащим сухой остаток, прибавляли 3 мл толуола и 2 мл ферротиоцианатного реактива, прогревали 60 секунд при 50-60°С, для ускорения реэкстракции липидов, встряхивали в течение 1 минуты, затем оставляли на несколько минут для расслоения фаз. Фотометриро- вали органическую фазу (толуол) при длине волны 470^490 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм.
Содержание отдельных фракций липидов оценивали после разделения их методом одномерной восходящей хроматографии на пластинках «Silufol UV 254» [Финдлей Дж., Эванс У., 1990]. Разделение липидов проводили в системе растворителей гексан/диэтиловый эфир/метанол/ледяная уксусная кислота в соотношении 90:20:3:2. Основные классы фосфолипидов смотрели в системе растворителей, которая состояла из смеси хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода в соотношении 60:25:1:4. Пятна визуализировали нагреванием пластин при Ю5°С после предварительного опрыскивания 5% раствором фосфорно- молибденовой кислоты в 96% этиловом спирте. Идентификацию фракций осуществляли по Rf (отношение расстояния, пройденного фракцией исследуемого вещества к расстоянию, пройденному фронтом растворителя), а также с помощью свидетелей. Количественное определение липидов осуществляли денситометри- рованием окрашенных пятен на денситометре БИАН-170.
Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах эритроцитов оценивали по содержанию в них диеновых коньюгатов и малонового диальдегида. Метод определения содержания диеновых коньюгатов в мембранах эритроцитов основан на интенсивном поглощении коньюгированными диеновыми структурами гидроперекисей липидов в области 233-234 нм [Владимиров Ю.А., 1998]. Экстракцию липидов эритроцитарных мембран проводили смесью гептан- изопропанол (1:1) в соотношении 1:20 (по объему). После встряхивания в течение 15 минут приливали раствор хлороводородной кислоты, чем вызывали расслоение фаз. Верхнюю фазу отбирали и определяли оптическую плотность при длине волны 233 нм. Результаты измерений выражали в относительных единицах величины оптической плотности на 1 мг белка [Косухин А.Б., Ахметова Б.С., 1987].
Содержание малонового диальдегида в мембранах эритроцитов определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Владимиров Ю.А., 1998]. Принцип метода состоит в образовании окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы ТБК, с максимумом поглощения в красной области видимого света.
К суспензии мембран эритроцитов добавляли трис-HCl буфер, 20% трихло- руксусную кислоту и 0,8% ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 минут, затем центрифугировали и измеряли оптическую плотность надо- садка при длине волны 532 нм. Количество МДА в ммоль/мг белка рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции k=T,56T0″5 М”1 •см .
Антиокислительную активность мембран оценивали по накоплению МДА в суспензии теней эритроцитов при индукции перекисного окисления липидов 10~6 М раствором Fe2S04-7H20. Инкубационную смесь, состоящую из трис-HCl буфера (рН 7,4), суспензии мембран эритроцитов и прооксиданта, помещали в термостат при 37°С на 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 20% раствора три- хлоруксусной кислоты и определяли содержание МДА.
Количество белка в суспензии теней эритроцитов определяли микробиурето- вым методом [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982]. К 0,1 мл суспензии мембран добавляли 3,5 мл 3% раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Через 30 минут
измеряли экстинкцию при длине волны 330 нм. Количество белка определяли по калибровочному графику и выражали в мг/мл суспензии.
Изучение влияния исследуемых экстрактов на систему гемостаза заключалось в определении следующих гемостазиологических параметров: агрегации тромбоцитов, активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени, а также коагулографических показателей.
Для оценки агрегации тромбоцитов применялся нефелометрический метод Born G. V. R. (1962), суть которого заключается в том, что при добавлении проаг- регантов в плазме происходит изменение ее оптической плотности за счет укрупнения частиц и увеличения свободных пространств [Вот О.У.Я., 1962]. Использовали плазму крови, стабилизированную 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Центрифугированием крови при 800 об/мин в течение 10 мин получали богатую тромбоцитами плазму, а при 3000 об/мин в течение 20 мин – бедную тромбоцитами плазму. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ, в конечной концентрации 4×10″5 М. Агрегатограммы записывали на агрегометре АТ-2 с регистратором Н-392. На агрегатограмме определяли максимальное изменение оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы (амплитуду агрегации в %) после добавления АДФ.
Для изучения антиагрегантной активности сосудистой стенки у крыс под эфирным наркозом выделяли сегмент брюшной аорты. В течение 3 мин проводили инкубацию сосудистого сегмента (массой 4-5 мг) крыс линии БНЯ и сегментов сосудов крыс ЭНЯ, предварительно получавших в течение 14 дней исследуемые экстракты, с последующей регистрацией АДФ-индуцированной агрегацией тромбоцитов. Полученные результаты сравнивали с данными агрегации тромбоцитов в плазме спонтанно-гипертензивных крыс без предварительной инкубации с сегментом сосуда.
Для оценки спектра антиагрегантной активности исследуемых экстрактов использовали индукторы агрегации: АДФ (4×10″5 М), коллаген (50 мкг/мл), тромпбин (0,3 ЕД/мл), арахидоновую кислоту (3,3×10″ М). Исследуемые экстракты вносили в пробу за 15 мин до агрегации в объеме 10 мкл в конечной концентрации 1×10″5 г/мл.
Коагулограммы регистрировали на коагулографе Н334 [Балуда В.П. и др., 1980]. Принцип метода основан на измерении электрической сопротивляемости крови, залитой в кювету с двумя электродами. Кювета совершает колебательные движения, благодаря чему кровь попеременно замыкает и размыкает электроды. При помощи самопишущего устройства этот процесс отражается на движущейся диаграммой ленте. По коагулограмме определяли следующие показатели:
- Т] – начало свертывания (сек). Время от начала исследования до первого колебания с уменьшенной амплитудой.
- Т2 – продолжительность свертывания (сек). Время от первого колебания с уменьшенной амплитудой до первого колебания с минимальной амплитудой.
- Тз – конец свертывания (сек). Время от начала исследования до первого колебания с минимальной амплитудой.
АЧТВ определяли на коагулометре KG-4 (Cormay) с использованием диагностического набора АПТВ(АЧТВ)-Е1-тест (ООО «Технология-стандарт»).
Протромбиновое время определяли оптическим методом Квика на коагулометре KG-4 Cormay с использованием диагностических тест-систем Техпла- стин™-тест (R) (ООО «Технология-стандарт») [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001].
Формирование фибринового сгустка в плазме крови под действием экзогенного тромбина изучали турбидиметрическим методом [Щербак И.Г. и др., 2001]. Принцип метода основан на регистрации изменения оптических свойств инкубационной среды при образовании фибринового сгустка. Оценивается степень поглощения светового излучения твердыми взвешенными частицами – метод оптической турбидиметрии. Динамика светопоглощения позволяет оценивать скорость и продолжительность процесса полимеризации фибрина в плазме крови. Для исследований использовали стабилизированную 3,8% натрия цитратом плазму экспериментальных животных (крысы-самцы Вистар с моделью ишемии головного мозга). Процесс гемокоагуляции инициировали добавлением тромбина (2 мг/мл). Исследуемые экстракты вносили в пробы за 15 мин до агрегации в объеме 10 мкл в конечной концентрации 1×10″5 г/мл. Регистрацию светопоглащения инкубационной среды проводили на спектрофотометре Hitachi при длине волны 340 нм.
Для оценки ЭЭГ применяли метод компрессированного спектрального анализа. Регистрацию ЭЭГ проводили монополярным способом. Перед началом регистрации животные в течение 1,5 часов привыкали к обстановке экспериментальной камеры. Электрограммы записывали с помощью электроэнцефалографа “Эра-9” и магнитографа “1296” фирмы “OTE-Biomedica”. Фурье-анализ проводили на спектроанализаторе той же фирмы. Определяли общую мощность спектра и амплитуды отдельных диапазонов, эпоха анализа составляла 248 с. При количественном анализе спектр колебаний ЭЭГ разбивали на 5 исходных диапазонов, согласно рекомендациям международной федерации обществ электроэнцефалографии и клинической нейрофизиологии: 5 – дельта (0,5 – 4,0 колебаний в секунду), 0 – тета (4,0 – 8,0), а – альфа (8 -12), (3 – (12 – 32) [Воронина Т.А. и др., 1987]. Предметом окончательного анализа служили средние значения отклонения общей мощности (Е) и мощностей отдельных диапазонов от соответствующих исходных величин. Коэффициент асимметрии рассчитывали во всех сериях как отношение мощности выбранного диапазона в левом полушарии к мощности этого же диапазона в правом полушарии.
Размер зоны инфаркта миокарда определяли по методике А.Х. Когана и соавторов [Коган А.Х. и др., 1984]. Некротизированные зоны визуализировали реакцией ткани миокарда с нитросиним тетразолием. Рассчитывали (в %) соотношение массы некротизированного миокарда к общей массе левого желудочка.
Системное артериальное давление регистрировали под эфирным наркозом прямым методом в общей сонной артерии с помощью датчика ДДА-2 от полиграфа “Салют”.
3.3. Техника проведения экспериментов
Кровь для исследования забирали под эфирным наркозом из общей сонной артерии. Для исследования вязкости крови и плазмы, электрофоретической подвижности эритроцитов, концентрации фибриногена в качестве антикоагулянта использовали натрия цитрат (3,8%) в соотношении с кровью 9:1; для определения деформируемости и агрегационной активности эритроцитов антикоагулянтом служил гепарин в конечной концентрации 50 ЕД/мл крови.
Для выявления гемореологических свойств исследуемых экдистероидсодер- жащих экстрактов и их фракций использовали модель синдрома повышенной вязкости крови (СПВК) in vitro [Плотников М.Б. и др., 1996]. Для воспроизведения модели СПВК in vitro кровь забирали из общей сонной артерии у крыс под эфирным наркозом и стабилизировали 3,8% натрия цитратом в соотношении 9:1. После измерения исходных значений вязкости крови, обратимой агрегации и деформируемости эритроцитов пробы в объеме 0,5 мл помещали в термостат и инкубировали в течение часа при 43,5°С. Исследуемые субстанции или растворитель (0,9% раствор натрия хлорида) вносили в пробы крови за 15 минут термостатирования в объёме 10 мкл в конечной концентрации Г10″ – 110″ г/мл. Препаратом сравнения служил стандартизированный экстракт гинкго билоба (EGb 761) — танакан (Beaufur Ipsin International). Исследуемые экстракты и препарат сравнения вносили в пробы крови за 15 минут до термостатирования в объёме 10 мкл в конечной концентрации Г10″5 г/мл. В контрольные пробы крови вносили эквиобъ- емное количество растворителя (изотонический раствор натрия хлорида). Для выявления вклада различных групп биологически активных веществ (БАВ) в гемо- реологические свойства цельных экдистероидсодержащих экстрактов исследовали влияние отдельных фракций на вязкость крови, агрегацию и деформируемость эритроцитов в условиях модели СПВК in vitro [Плотников М.Б. и др., 1996]. Получение различных фракций экдистероидсодержащих экстрактов производили путем последовательной обработки цельного экстракта растворителями с различной полярностью. Сухие экстракты левзеи сафлоровидной, лихниса хальцедонского, серпухи венценосной, а также их водные, бутанольные и суммарные фракции экдистероидов растворяли в дистиллированной воде, хлороформную фракцию – 45% этаноле, этилацетатные фракции – в 70% этаноле, суммарные фракции флавоноидов – в НереБ-буфере. Исследуемые экстракты и их фракции вносили в пробы крови за 15 минут до термостатирования в объёме 10 мкл в конечной кон-центрации ПО” – 110″ г/мл. Выбор конечных концентраций исследуемых субстанций обусловлен полученными ранее данными [Плотников М.Б. и др., 1998]. В контрольные пробы крови вносили эквиобъемное количество соответствующего растворителя. Сухие экстракты левзеи сафлоровидной, лихниса хальцедонского, серпухи венценосной, а также их водные, бутанольные, хлороформные и этилацетатные фракции вносили в пробы крови в конечной концентрации 1’10”5 г/мл. Суммарные фракции флавоноидов, выделенных их этих экстрактов вносили в пробы крови в конечной концентрации Г10″6 г/мл, суммарные фракции экдисте-роидов-ГЮ” г/мл.
На моделях СПВК in vivo все исследуемые экстракты вводили в дозе 150 мг/кг, что основано на полученных ранее данных [Плотников М.Б. и др., 1998].
Ишемию головного мозга у крыс Вистар массой 200-250 г. воспроизводили по методике М.Б. Плотникова и соавторов [Плотников М.Б. и др., 1994]. Под эфирным наркозом выделяли общие сонные артерии и при помощи электромагнитного расходомера крови MFV-1100 (Nihon Kohden, Япония) измеряли интенсивность кровотока. Затем полностью перевязывали левую сонную артерию и дозированной перевязкой, под контролем расходомера крови, ограничивали кровоток по правой сонной артерии до 40-50% от исходного уровня [Плотников М.Б. и др., 1994]. ЭЭСР вводили через 2 часа после лигирования общих сонных артерий в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно в 1% крахмальной слизи ежедневно в течение 5 дней. Контрольные животные получали эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. На 5-е сутки посте лигирования сонных артерий у животных забирали кровь под эфирным наркозом и определяли гемореологические параметры.
Инфаркт миокарда создавали у крыс Вистар массой 200-250 г. Доступ к сердцу производили под эфирным наркозом путем вскрытия грудной клетки по среднеключичной линии в 4-м межреберье. Затем накладывали лигатуру на левую коронарную артерию на уровне первой трети расстояния от пульмонального конуса до верхушки сердца. Выделение сердца и лигирование коронарной артерии проводили в условиях искусственной вентиляции легких. Верифицировали инфаркт миокарда электрокардиографически, по характерным признакам на электрокардиограмме: появление зубца Q, качественные изменения комплекса QRS (исчезновение зубца R, появление комплекса типа QS), смещение сегмента ST относительно изолинии [Коган А.Х., 1979; Сысоева H.A. и др., 1981]. ЭЭСР вводили опытным животным через 2 часа после лигирования коронарной артерии в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно в 1% крахмальной слизи ежедневно в течение 5 дней. Контрольные животные получали эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. На 5-е сутки после создания инфаркта оценивали гемореологический статус животных. Кровь забирали из общей сонной артерии под легким эфирным наркозом.
Для исследования изменений реологических свойств крови при артериальной гипертензии использовали линию спонтанно-гипертензивных крыс (spontaneously hypertensive rats – SHR), которая в настоящее время считается наиболее адекватной моделью эссенциальной гипертензии человека [Гуревич М.И., 1981]. Для экспериментов использовали животных массой 200-250 г. ЭЭСР вводили крысам линии SHR в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно в 1% крахмальной слизи ежедневно в течение 14 дней. Контрольные животные получали эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. Гемореологический статус животных оценивали на 14-е сутки после начала введения исследуемых экстрактов. Кровь забирали из общей сонной артерии под эфирным наркозом.
Для исследования нарушений гемореологических параметров при сахарном диабете использовали модель стрептозотоцин-индуцированного диабета [Ferner R.E., 1992]. Модель стрептозотоцин-индуцированного диабета воспроизводили у крыс Вистар массой 200-250 г. Верификацию сахарного диабета осуществляли определением глюкозы в крови. Определение концентрации глюкозы в цельной крови проводили биосенсорным глюкозооксидазным методом с помощью портативного прибора “SmartScan” (“Johnson & Johnson company”, USA). Стрептозото- цин (“Sigma-Aldrich”, USA) вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 50 мг/кг. Для эксперимента отбирали животных с содержанием глюкозы в крови не менее 15 ммоль/л. ЭЭСР растворяли в дистиллированой воде и вводили опытным животным с момента развития выраженной гипергликемии (через 2-е суток после введения стрептозотоцина) в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно ежедневно в течение 14 дней. Контрольные животные получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. На 14-е сутки после воспроизведения сахарного диабета оценивали ,гемореологический статус животных и определяли содержание глюкозы крови. Животные в ходе эксперимента имели свободный доступ к воде и пище.
В качестве модели СПВК при наследственном гипоталамическом несахарном диабете использовали крыс линии Brattleboro массой 200-250 г. Крысы линии Brattleboro являются клинически адекватной моделью несахарного мочеизнурения, в основе которого лежит нарушение синтеза и экскреции антидиуретического гормона – вазопрессина [Valtin Н., Schroeder H.A., 1964; Schmale H., Richter D., 1984]. ЭЭСР вводили опытным животным в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно в 1% крахмальной слизи ежедневно в течение 10 дней. Контрольные животные получали эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. На 10-е сутки оценивали ге- мореологический статус экспериментальных животных, забирая кровь для исследований из общей сонной артерии под легким эфирным наркозом. Животные в ходе эксперимента имели свободный доступ к воде и пище.
Для регистрации ЭЭГ использовали нихромовые электроды в заводской изоляции. Электроды вживляли животным под этаминаловым наркозом (50 мг/кг внутрибрюшинно) в область зрительной коры головного мозга. Координаты точек вживления (АР – +6, D и S – 1,5, Н – 1,5) рассчитывали по атласу Е. Фифковой и Дж. Маршалл [Фифкова Е., Маршал Дж., 1962]. Электрод сравнения имплантировали в носовые кости. Герметизацию черепа и крепление на нём электродов осуществляли цементом “Фосфат” и самотвердеющей пластмассой “Протакрил”. Через 5 суток животных брали в эксперимент.
ЭКГ регистрировали у крыс под эфирным оглушением в положении животного спиной вверх во II стандартном отведении. Измеряли следующие параметры: частоту сердечных сокращений, амплитуду зубцов Р, R, Т, Q и длительность интервалов PQ, QRS, QT.
Актопротекторную активность исследовали в условиях модели истощающей физической нагрузки (бег на тредмиле) [Бобков Ю.Г. и др., 1984]. Эксперименты проводили на крысах-самцах Вистар массой 180-200 г. Изучали актопротекторную активность ЭЭСР у животных с предварительным тренировочным периодом и без такового. Животные были разделены на 5 групп: интактные, контроль I (нетренированные без введения ЭЭСР), опыт I (нетренированные с введением ЭЭСР), контроль II (тренированные без введения ЭЭСР) и опыт II (тренированные с введением ЭЭСР). Схема эксперимента представлена на рис. 4. Опытным животным вводили ЭЭСР в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно ежедневно в течение 14 дней; контрольные животные получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Начиная с 7-х суток после начала введения препарата, животных групп контроль II и опыт II подвергали тренировочным нагрузкам на тредмиле (бег по 30 мин ежедневно; скорость ленты 22,5 м/мин). На 14-е сутки после начала введения ЭЭСР животным всех групп (за исключением интактных) предъявляли истощающую физическую нагрузку. Критерием утомления служил отказ животного от бега, несмотря на электрическую стимуляцию. Сразу после забега у животных под эфирным наркозом забирали кровь из общей сонной артерии и определяли гемореологические параметры и показатели углеводного обмена: глюкозу, лактат и пируват. Глюкозу в крови определяли биосенсорным глюкозоокси- дазным методом описанным выше. Концентрацию лактата в крови определяли методом Баркера-Саммерсона [Меньшиков В.В. и др., 1987], пирувата – модифицированным методом Умрайта [Камышников B.C., 2000].
Рис. 4. Схема экспериментов по оценке актопротекторного действия ЭЭСР в условиях истощающей физической нагрузки
Для исследования эффективности совместного применения ЭЭСР и низкоинтенсивной тренировочной нагрузки при ишемических повреждениях миокарда использовали крыс-самцов Вистар массой 200-220 грамм с воспроизведенным у них инфарктом миокарда. Животные были разделены на 4 группы: интактные, контроль I (инфаркт без физической нагрузки и без введения ЭЭСР), контроль II (инфаркт с физической нагрузкой без введения ЭЭСР) и опыт (инфаркт с физической нагрузкой с введением ЭЭСР). Опытным животным вводили ЭЭСР в дозе 150 мг/кг внутрижелудочно ежедневно в течение 10 дней, начиная с первого дня после воспроизведения инфаркта миокарда; животные групп контроль I и контроль II получали эквиобъемное количество дистиллированной воды.
Начиная с 5-х суток, когда у всех животных исчезали ЭКГ-признаки острого инфаркта миокарда, крыс групп контроль II и опыт подвергали тренировочным нагрузкам низкой интенсивности (бег на тредбане по 30 мин ежедневно; скорость ленты 12,5 м/мин). На 10-е сутки после воспроизведения инфаркта миокарда, сразу после окончание бега под легким эфирным наркозом исследовали параметры ЭКГ, далее забирали кровь из общей сонной артерии для исследования геморео- логического статуса и параметров углеводного обмена.
После оперативных вмешательств (моделирование ишемии головного мозга, инфаркта миокарда и вживления электродов) животным проводили антибиотико- терапию и обработку антисептиками раневых поверхностей.
Для определения биологически активных веществ (БАВ), оказывающих влияние на гемореологические показатели нами было проведено последовательное фракционирование экстрактов левзеи сафлоровидной, лихниса хальцедонского и серпухи венценосной растворителями с различной полярностью (хлороформ, эти- лацетат, n-бутанол, вода).
Исследование проводили следующим образом: 100 г сухого экстракта растворяли в 250 мл воды дистиллированной, нагретой до 80°С, полученный раствор переносили в делительную воронку и исчерпывающе экстрагировали хлороформом (не менее 5 раз), объединяли хлороформные извлечения, высушивали безводным натрия сульфатом и растворитель отгоняли под вакуумом. После удаления хлороформного слоя, водный остаток подобным образом экстрагировали эти- лацетатом и n-бутанолом. Обнаружение различных групп БАВ проводили методом тонкослойной хроматографии и соответствующими химическими реакциями [Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К., 1974; Холодова Ю.Д., 1977; Вересковский В.В., Чекалинская И.И., 1977; Якубова М.Р. и др., 1978; Вересковский В.В., Чекалин- ская И.И., 1980; Ахрем A.A., Ковганко Н.В., 1989].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ “Statistica for Windows 6.0й. В таблицах представлены средние значения показателей и стандартные ошибки среднего значения. Нормальность распределения оценивали с помощью показателей асимметрии и эксцесса; достоверность различий (р<0,05) между сериями определяли с помощью Mann-Whitney U test и t-критерия Стьюдента. Для оценки статистической связи между исследуемыми параметрами использовали метод ранговой корреляции Спирмена.
