Министерство здравоохранения РФ
Рязанский государственный медицинский
университет имени академика И.П.Павлова
Автор:
БУРМИСТРОВА ЛИЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА
Диссертация
«ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОХИМИЧЕСКАЯ
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА»
Содержание
Глава 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.
Материалы и объект
исследования
Материалами исследования служили трутневый расплод и, в качестве средства сравнения, маточное молочко, заготовленные на пасеках Рязанской области и Опытно-производственного племенного хозяйства по разведению пчел “Краснополянское” Краснодарского края в разные сроки пчеловодческого сезона.
Для производства трутневого расплода еще с осени предшествующего года выделяли полноценные, сильные семьи пчел с матками старше одного года, которые весной откладывали трутневые яйца гораздо интенсивнее, чем более молодые матки. Эти семьи шли в зимовку с обильными запасами высококачественных углеводных и белковых кормов (2-3 хороших медо-перговых сота). Для получения трутневого расплода в самые ранние сроки в гнезда таким семьям, также с осени или после выставки их из зимовника, подставляли по 1 – 2 специально подготовленных с лета трутневых сота, заполненных медом не менее чем на половину.
Для сохранения пчелиных семей в зимний период создавали оптимальные условия (осеннее наращивание возможно большего количества физиологически полноценных для зимовки пчел, обильные запасы кормов, просторные гнезда из светло-коричневых сотов, гигроскопические утеплительные материалы, нормальная вентиляция гнезда, оптимальный режим температуры и влажности воздуха в зимовнике и т.д.), так как хорошо перезимовавшие пчелиные семьи раньше и интенсивнее начинают выращивать расплод, в том числе и трутневый.
Для ускорения выращивания трутней весной, в этот период поддерживали высокий уровень кормообеспеченности пчелиных семей (не менее 10-12 кг меда и 2-3 медоперговых сота), сдерживали расширение гнезд и тщательно утепляли их. Самый сильный стимулятор весеннего развития пчелиных семей – наличие поддерживающего медосбора, то есть источников свежего нектара и пыльцы. Поэтому при их недостатке пасеку вывозили на кочевку в места, где эти источники имеются. При отсутствии перговых сотов в гнездах пчелиных семей и их запаса на складе, отсутствии источников свежей пыльцы в окрестностях пасеки и невозможности вывезти пчел на кочевку, их регулярно подкармливали углеводно-белковым канди или заменителями пыльцы. В первой половине мая в средней полосе Европейской части России многие пчелиные семьи приступают к выращиванию трутневого расплода, которые также использовали для его получения, даже если их специально не готовили к этому.
Для повышения объема производства трутневого расплода использовали трутневые соты, а при их отсутствии в гнезда пчелиных семей подставляли строительные рамки с натянутой проволокой и полоской вощины или отстроенного сота на верхнем бруске. При наличии хотя бы небольшого поддерживающего медосбора пчелы очень быстро достраивали просвет такой рамки, главным образом, трутневыми ячейками, в которые матка тут же откладывала яйца. Для получения трутневых сотов использовали вощину с внутренним диаметром ячеек – 6,9 мм, которую подставляли в гнезда выделенных для этого пчелиных семей, как только наступал самый ранний поддерживающий медосбор. Соты, отстроенные на такой вощине, полностью состояли из трутневых ячеек.
В сезонном плане наиболее интенсивное выращивание трутневого расплода пчелиными семьями наблюдалось в роевой период, а с наступлением главного медосбора (обычно с конца июня – начала июля в средней полосе Европейской части России) прекращалось практически полностью. Таким образом, вторая половина мая и июнь представляли собою наиболее благоприятный период для получения трутневого расплода.
При организации производства трутневого расплода учитывали и породные особенности используемых в этих целях пчелиных семей. Так, в НИИ пчеловодства ранее было установлено, что семьи серых горных кавказских пчел и, в особенности, семьи-помеси от скрещивания маток этой породы со среднерусскими трутнями выращивают трутневого расплода существенно больше, чем семьи чистопородных среднерусских пчел.
Когда матки в избранных для этого семьях не очень охотно откладывали яйца в подставляемые трутневые соты, использовали семьи с матками-трутовками, откладывающими исключительно одни неоплодотворенные яйца.
Поскольку продолжительность эмбрионального развития (от откладки яйца и выхода из него личинки) у всех стаз пчелиной семьи составляет 3 суток, а запечатывают пчелы ячейку с трутневой личинкой через 7 суток после выхода из яйца (личинку рабочей пчелы – через 6 суток), сот с трутневыми личинками отбирали через 10 суток после того, как матка отложила в него яйца, то есть накануне запечатывания личинок.
Разновозрастный (9-11-суточный со дня откладки яиц), свежеотобранный трутневый расплод в сотах доставляли в лабораторию, где готовили гомогенат. Личинок и предкуколок извлекали из сота пинцетом или вытряхивали на поднос, после чего тщательно гомогенизировали и фильтровали через сито из нейлоновых тканей в охлажденные, чистые, обработанные спиртом флаконы темного стекла. Все операции по приготовлению гомогената трутневого расплода проводили в максимально короткие сроки с использованием охлажденной посуды, так как он еще в большей степени, чем молочко, подвержен воздействию окружающей среды. Прессование сота с расплодом значительно сокращало время его получения. Соты после извлечения расплода использовали для получения воска. Изменения качества гомогената легко обнаруживаются даже визуально органолептическими методами исследования: по мере окисления изменяется цвет (сереет, далее чернеет), появляется кислый запах, прогорклый вкус.
Поэтому, на начальном этапе наших исследований было проведено определение сроков хранения трутневого расплода при различных температурных условиях, в зависимости от способа консервации и стабилизации. Полученные результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4. Результаты хранения гомогената трутневого расплода в зависимости от способа консервации
| Способ
консервации |
Условия
хранения |
Срок
хранения |
Изменения в продукте |
|
Гомогенат трутне-вого расплода (без консервации) |
Температура окру-жающего воздуха: – в открытом виде – во флаконе из темного стекла
Т= +40С – +80С
Т= -80С – -40С
Т= -200С |
до 1 ч
до 8 ч
12-24 ч
до 30 сут
до 3 мес |
потемнение верхнего слоя, прокисание (ки-слый запах)
неравномерное размораживание, денатурация белков
|
|
960 спиртом |
Т= -80С – -40С |
до 1 мес |
потемнение верхнего слоя, прокисание (де-натурация белков, кислый запах), неравномерное размораживание
|
|
Спиртовым раст-вором прополиса: а) 30%-ым
|
Т= -80С – -40С |
до 1 мес |
то же |
|
б) 70%-ым
|
Т= -80С – -40С |
до 1 мес |
то же
|
|
Адсорбция:
на лактозо-глюко-зной смеси с аско-рбиновой кислотой (1:4)
на лактозо-глюко-зной смеси (1:6) а) сырой
б) высушенный до остаточной влажности 4-8%
|
Т= +40С – +80С
Т= +40С – +80С
|
до 1 мес
3-5 мес
2 года
|
пожелтение, кисловатый запах
без изменений показателей качества
|
Так как для консервации маточного молочка иногда рекомендуются спирт (Т.В. Виноградова и др., 1964) и прополис (Т.В. Вахонина и др., 1991, 1993, 1995), мы изучили действие этих веществ на гомогенат трутневого расплода. Свежеприготовленный гомогенат консервировали 96° спиртом, 30%- и 70%-ным спиртовыми растворами прополиса. Все консервирующие вещества в количестве 2% не изменяли физико-химических свойств гомогената, но и не позволяли увеличить срок хранения.
Поскольку наиболее эффективным способом стабилизации маточного молочка является адсорбция (Л.Н.Брайнес, 1968; Вахонина Т.В., 1993, 1995) в соотношении 1:4 на лактозо-глюкозной смеси (96-98% лактозы, 2-4% глюкозы), мы апробировали приемлемость этого способа для трутневого расплода. Однако, учитывая более высокую влажность и данные Института питания Российской Академии медицинских наук о транзитной роли лактозы, мы увеличили пропорцию адсорбент : продукт до 1:6 и изменили соотношение сахаров в адсорбенте. Адсорбент для гомогената трутневого расплода представляет собой однородную смесь взятых в равных пропорциях лактозы и глюкозы, предварительно высушенных до постоянной массы при температуре 105°С. Не имеющий кристаллизационной воды адсорбент связывает воду из гомогената. Увеличение процентного содержания глюкозы в адсорбенте придает трутневому расплоду приятный вкус. Быстрое усвоение глюкозы оказывает положительное влияние на организм.
При сравнительном изучении физико-химических свойств состава трутневого расплода и маточного молочка использовали свежеприготовленные нативные продукты пчеловодства или хранившиеся непродолжительное время при температуре минус 20°С.
При выполнении исследования по изучению биологической активности использовали стабилизированные, удобные в дозировании адсорбированные изучаемые продукты пчеловодства.
Объектом исследования при сравнительной оценке медико-биологических свойств трутневого расплода и маточного молочка служили половозрелые нелинейные крысы-самцы массой 130-240 г, содержащиеся в общих условиях вивария. Продукты пчеловодства вводили подопытным животным внутрь через металлический желудочный зонд в виде свежеприготовленных водных суспензий в объемной дозе, стандартизированной по маточному молочку – 10 мг/кг (И.Добровода, 1976). При этом объемная доза и для маточного молочка, и для трутневого расплода составила 0,5 мл/100 г массы тела. Кроме того, при изучении актопротекторных свойств трутневого расплода исследовали зависимость выраженности эффекта от дозы. При этом отдельной подопытной группе животных вводили двойную дозу трутневого расплода – 20 мг/кг.
2.2.
Методы изучения физико-химических свойств и состава
трутневого расплода и маточного молочка
Методы по ГОСТ 28888-90 «Молочко маточное пчелиное»
Поскольку объектом сравнения служил стандартизированный продукт, на который существует ГОСТ 28888-90 «Молочко маточное пчелиное», в котором подробно изложены методики контроля качества, мы сочли целесообразным привести лишь их перечисление без подробного описания. Эти исследования выполнены в лаборатории НИИ пчеловодства и включали определения:
– массовой доли воды (%) рефрактометрически;
– массовой доли сырого протеина (%) методом Къельдаля по общему азоту;
– массовой доли деценовых кислот (%) алкилиметрически, после их последовательного выделения;
– концентрации водородных ионов (pH) потенциометрически на pH-метре с чувствительностью 0,01;
– показателя окисляемости, характеризующего общее количество ненасыщенных соединений (использовали окислительно-восстановительный метод обесцвечивания 0,1 моль/дм3 раствора марганцово-кислого калия);
-содержание сульфгидрильных групп йодометрическим методом (Г.А.Уз-беков, 1964).
Микробиологические исследования
Микробиологические исследования выполнены на кафедре микробиологии РГМУ им. акад. И.П.Павлова под руководством проф. И.В.Смирнова. Определяли антимикробную активность (зона в мм) трутневого расплода и маточного молочка в отношении St. aureus 209P, E.coli M17, B. mycoides HB, а также обсемененность исследуемых продуктов непатогенными микробами (КОЕ/мл, г), согласно ГФ XI.
Исследования гормонального состава
Уровень содержания основных половых гормонов – тестостерона, прогестерона, пролактина, эстрадиола – определяли в растворах трутневого расплода и маточного молочка радиоиммуными методами с использованием стандартных наборов “Иммунотех” (Чехия) на аппаратуре радиоизотопной лаборатории ЦНИЛ РГМУ. Расчет производили на 100 г продукта.
Определение минеральных компонентов
Содержание минеральных компонентов (меди, цинка, марганца, магния, кальция, натрия, калия) определяли в озоленной навеске маточного молочка и трутневого расплода при температуре 450°С. Для получения растворимых солей ее минерализовали в парам азотной кислоты, затем растворяли в деионизированной воде. Определение проводили на атомно-адсорбционном спектрофотометре С-115 на кафедре общей химии РГМУ им. акад. И.П.Павлова под руководством доцента В.З.Лакштанова.
2.3.
Методики проведения опытов
по сравнительной
экспериментально-фармакологической
оценке трутневого
расплода и маточного молочка
2.3.1. Оценка влияния трутневого расплода и маточного молочка на показатели физической работоспособности
2.3.1.1. Характеристика экспериментальной модели и схемы проведения опыта
Достаточно высокая информативность плавательного теста при оценке влияния фармакологических веществ (Г.М.Молодавкин и др., 1994; И.Л.Ласко-ва и др., 1995) и биологически активных продуктов пчеловодства (В.Г.Макаро-ва и др., 1995, 1996; Л.Г.Чугунова и др., 1997; В.А.Киселева, 1998) на физическую работоспособность предопределила выбор этой экспериментальной модели. Как и ранее, при проведении подобных работ на кафедре фармакологии РГМУ им. акад. И.П.Павлова, использована методика многократных двойных плаваний «до предела».
Опыты проведены на крысах-самцах массой 130-160 г, плавающих при пробном тесте 130 ± 30 с. Стандартизация условий выполнения интенсивной физической нагрузки предусматривала плавание животных в специальных аквариумах диаметром 20 см и высотой водного столба 70 см в одно и то же время суток (8-10 ч), натощак и через 1 ч после введения трутневого расплода и маточного молочка. Температура во время эксперимента поддерживалась в пределах 28-30°С. Все животные плавали с отягощением: к основанию хвоста фиксировали грузик массой, равной 15% от массы тела.
Продолжительность выполнения нагрузки регистрировали секундомером с момента погружения крысы в воду до момента прекращения ею активных плавательных движений из-за наступающего изнурения и погружения на дно. После этого животное извлекали из воды и в течении 60 минут обсушивали в вентилируемой теплым воздухом камере, после чего подвергали повторному плаванию «до предела». Это позволило кроме исходных данных (продолжи-тельность первичного и повторного плаваний) регистрировать еще две производные величины – суммарную продолжительность двойного плавания (СПДП) и показатель восстановления работоспособности (ПВР: отношение продолжительности повторного плавания к первичному, выраженное в процентах), что дополнительно увеличивает чувствительность методики и позволяет более точно оценить различия в выраженности актопротекторного эффекта сравниваемых биологически активных продуктов пчеловодства. После начального теста подопытные животные еще трижды выполняли двойные плавания через каждые 4 дня, то есть на 5-й (второй тест), 10-й (третий тест) и на 15-й (четвертый, заключительный тест) дни эксперимента. Данный режим широко используется в фармакологических исследованиях при изучении актопротекторного действия, поскольку он максимально исключает влияние на значение определяемых показателей как привыкания к нагрузке, так и переутомления животных в ходе многократных плаваний (В.Г.Макарова и др., 1995, 1996).
Схема экспериментов предусматривала формирование следующих серий, в каждой по 7 крыс:
1) животные, выполняющие плавательные нагрузки на фоне ежедневного перорального введения (в качестве контрольной манипуляции) физиологического раствора натрия хлорида в дозах эквиобъемных назначаемым продуктам пчеловодства (обозначение этой серии в тексте и в таблицах – «плавание»);
2) крысы, которым в течении 15 дней, начиная со следующего дня после выполнения первого, исходного, плавательного теста, внутрь через желудочный зонд вводили свежеприготовленную водную суспензию маточного молочка в дозе 10 мг/кг (обозначение серии – «ММ + плавание»);
3) животные, которым по аналогичной схеме назначали трутневый расплод в дозе 10 мг/кг (обозначение серии – «ТР-1 + плавание»);
4) крысы, получавшие вдвое более высокую дозу расплода («ТР-2 + плавание»);
5) интактные животные, находящиеся весь экспериментальный период наряду с опытными в стандартных условиях содержания и кормления (обозначение этой серии в таблицах – «контроль»).
После выполнения последней плавательной нагрузки у наркотизированых эфиром животных проводили взятие биосубстратов – крови из брюшной аорты, тканей миокарда и скелетной мышцы, в которых определяли ряд биохимических показателей. В цельной крови фиксировали параметры газового состава и кислотно-щелочного равновесия. В сыворотке, полученной после центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин, проводили определение основ-ных метаболитов, характеризующих состояние белкового, углеводородного и липидного обменов – концентрацию общего белка, глюкозы, холестерина и общих липидов, а также уровень одного из глюкокортикостероидов – кортизола. В гомогенате тканей миокарда и скелетной мышцы оценивали содержание пирувата и гликогена.
2.3.1.2. Методы и показатели оценки актопротекторного эффекта
Массаметрические методы
На каждом этапе эксперимента на высокоточных весах ВЛКТ регистрировали массу тела экспериментальных животных и ее производные – абсолютное и относительное изменение по сравнению с исходными данными и с показателями серии «плавание».
Физиологические методы
Оценку физической работоспособности проводили по длительности первичного и повторного плаваний и их производных – СПДП, ПВР, а также по общему показателю работоспособности (ОПР: общая продолжительность физической нагрузки за четыре двойных плавательных теста).
Биохимические методы
На цифровом анализаторе ОР-215 (RADELKIS, Венгрия) проводили определение параметров газового состава крови и кислотно-щелочного равновесия: парциального давления кислорода (pO2), двуокиси углерода (pCO2), значений pH и концентрации гидрокарбонатного аниона (HCO3). Величину pH определяли после установки эталонными растворами оптимального диапазона – 6,843-7,384. Содержание HCO3-иона рассчитывали автоматически на завершающем этапе анализа.
В сыворотке крови определяли:
- концентрацию общего белка (г/л) унифицированным методом по биуретовой реакции с использованием стандартного набора реактивов (г.Купавна, Россия);
– содержание глюкозы (ммоль/л) глюкозооксидазным методом с помощью стандартного набора реактивов “фотоглюкоза” (МП “Импакт”, Москва);
- общее количество холестерина (ммоль/л) прямым методом Илька, основанном на реакции с уксусным ангидридом, используя стандартный набор МП “Эколаб”, г.Электросталь;
- общее количество липидов (ммоль/л) фотометрическим методом по концентрации органического фосфата, освободившегося при кислотном гидролизе;
- уровень кортизола (нмоль/л) определяли радиоиммунологическим методом с использованием стандартных наборов “Иммунотех” (Чехия) на аппаратуре ЦНИЛ РязГМУ;
В тканях миокарда и скелетной мышцы определяли:
– содержание пирувата (МЕ/г) колориметрическим методом, основанном на восстановлении пирувата до лактата в присутствии НАДН под действием лактатдегидрогеназы, с использованием стандартных наборов фирмы «Lache-ma» (Чехия). Измерения проводили на спектрометре СФ-26 при длине волны 520 нм;
– содержание гликогена в ткани миокарда (мг/г) определяли глюкозооксидазным методом по количеству образовавшейся глюкозы при гидролизе гликогена в щелочной среде.
2.3.2. Методика оценки гонадотропного эффекта трутневого расплода и маточного молочка
2.3.2.1. Моделирование экспериментального гипогонадизма. Схема исследования
Гонадотропную активность исследуемых продуктов пчеловодства оценивали по их влиянию на течение посткастрационного периода у половозрелых крыс-самцов, подвергнутых односторонней кастрации. Данная экспериментальная модель широко используется в доклинических исследованиях при изучении гонадотропной активности, так как позволяет достаточно корректно определить степень влияния анализируемых веществ на скорость восстановительного периода, реализуемого различными механизмами, тогда как при двухсторонней кастрации терапевтическим эффектом обладают лишь средства, содержащие в своем составе половые гормоны и восполняющие только периферическое звено эффекторной системы.
Опыты выполнены на беспородных половозрелых крысах-самцах массой 140-220 г. Учитывая литературные данные о динамике течения посткастрационного периода у крыс при использовании этой модели (А.Н.Рябков и др., 1997), сравнительный анализ регистрируемых величин проводили в течение 15 дней после тестэктомии: на 5-, 10- и 15-й дни. Одностороннюю кастрацию в виде удаления правого яичка проводили у наркотизированных эфиром крыс через мошоночный разрез после перевязки сосудов и семявыводящего протока с последующим наложением швов и обработкой раны антисептиками. Схема экспериментов предусматривала выделение следующих групп сравнения, или серии, в каждую из которых было включено по 7 животных: 1) крысы, находившиеся в общих условиях содержания и кормления наряду с опытными сериями, которым в качестве манипуляционного контроля проводили полный комплекс хирургических операций (наркоз, разрез мошонки, наложение швов) за исключением тестэктомии, после чего ежедневно внутрь вводили физиологический раствор натрия хлорида в объемной дозе 5 мл/кг (условное обозначение этой серии в тексте и в таблицах – «контроль»); 2) кастрированные животные, также получавшие внутрь после операции только физиологический раствор в течение 5, 10, 15 дней («кастрация, 5 дней», «кастрация, 10 дней», «кастрация, 15 дней»); 3) крысы, которым сразу после односторонней кастрации через желудочный зонд внутрь вводили свежеприготовленную водную суспензию трутневого расплода в весовой дозе 10мг/кг (с учетом адсорбента – 70 мг/кг), что соответствует объемной дозе 5 мл/кг («кастрация, 5 дней + ТР», «кастрация, 10 дней + ТР», «кастрация, 15 дней + ТР»); 4) животные, которым аналогичными курсами и способом вводили водную суспензию эталонного препарата – адсорбированного на лактозе маточного молочка в весовой дозе 10 мг/кг (с учетом адсорбента – 50 мг/кг), или в объемной дозе – 5 мл/кг («кастрация, 5 дней + ММ», «кастрация, 10 дней + ММ», «кастрация, 15 дней + ММ»). Для учета возможных изменений фиксируемых параметров, вызываемых сравниваемыми биологически активными продуктами пчеловодства у некастрированных животных, были дополнительно включены серии «интактные + ТР, 15 дней» и «интактные + ММ, 15 дней», в которых ТР и ММ назначались животным с сохраненными яичками.
По завершению каждого этапа крыс взвешивали на весах ВЛКТ-500-М, нарктизировали эфиром, у них извлекали и взвешивали на торсионных весах семенник, семенные пузырьки (до удаления из них семенной жидкости) и предстательную железу. Из брюшной аорты забирали кровь, в сыворотке которой определяли концентрацию тестостерона. Помимо этого в семенной жидкости фиксировали уровень фруктозы.
2.3.2.2. Методы и показатели, применяемые для анализа гонадотропного действия
Массаметрические методы
Определяли комплекс показателей прямой массаметрии: массу тела, семенников, семенных пузырьков, предстательной железы. Для более корректного анализа происходящих изменений рассчитывали значения так называемых весовых коэффициентов, отражающих сопряженность органных изменений с мас-сой тела. Расчет весовых коэффициентов проводили следующим образом:
1) весовой коэффициент = масса семенника (г)
для семенника 1/100 массы тела (г) ;
2) весовой коэффициент = масса семенных пузырьков (г)
для семенных пузырьков 1/1000 массы тела (г) ;
3) весовой коэффициент = масса предстательной железы (г)
для предстательной железы 1/1000 массы тела (г) .
Биохимические методы
Концентрацию фруктозы, позволяющей судить об андрогенной активности, в содержимом семенных пузырьков после его выдавливания на часовое стекло, определяли по интенсивности окрашивания с резорцином (В.Г.Горюнов и др., 1993).
Уровень тестостерона в сыворотке, полученной после центрифугирования крови из брюшной аорты при 3000 об/мин в течение 10 минут, определяли радиоиммунологическим методом с использованием стандартных наборов “Иммунотех” (Чехия) на аппаратуре радиоизотопной лаборатории ЦНИЛ РГМУ.
Все первичные биохимические, массаметрические и физиологические данные и их производные были подвергнуты математико-статистической обработке на персональном компьютере “Pentium 166 MMX” с использованием офисного пакета “Microsoft Office Professional” с расчетом средней, ее ошибки, значений критерия Стьюдента и достоверности фиксируемых различий.
